بررسی القاء آپوپتوزیز بوسیله وکتور بیان کننده sirna در رده سلولی k564 در محیط کشت

اهداف: طراحی sirna مناسب بر علیه ژن bcr/abl و به کارگیری وکتور بیان کننده مناسب (prna-h1.1/neo)، به منظور بیان آن در رده سلولی سرطان لوکمی k562 و بررسی میزان تاثیر آن از طریق بررسی القاء آپوپتوزیز پس از انتقال وکتور به داخل سلول.

روش ها: بر اساس توالی mrna مولکول کایمرای bcr-abl، توالی مناسب انتخاب و پس از طراحی آن به صورت shrna به dna بیان کننده shrna تبدیل و بداخل وکتور بیان prna-h1.1/neo منتقل شد. سپس صحت عمل کلونینگ، با استفاده از pcr و تعیین سکانس مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از تکثیر وکتور کلون شده با استفاده از لیپوفکتامین بداخل سلول k562 منتقل گردید و کارآیی روش انتقال با استفاده وکتور بیان کننده gfp مورد ارزیابی قرار گرفت. از وکتور اولیه کلون نشده و sirna با توالی غیراختصاصی نیز به عنوان کنترل منفی استفاده شد. پس از انتقال وکتور بداخل سلول بررسی القاء آپوپتوزیز و وابستگی آپوپتوزیز به زمان از طریق سنجش میزان آپوپتوزیز در زمان های مختلف با کمک کیت تشخیص آپوپتوزیز و با استفاده از روش الایزا مورد مطالعه قرار گرفت.

یافته ها: با استفاده از نتایج حاصل از pcr و هم چنین تعیین سکانس صحت عمل کلونینگ مورد تایید قرار گرفت. با بیان پروتئین gfp و ظهور رنگ سبز فلورسانس در سلولهای حاوی وکتور، عمل انتقال وکتور میزان کارآیی روش انتقال و بیان وکتور در سلول مورد تایید قرار گرفت کارآیی لیپوفکتامین معادل 44% بود. میزان القاء آپوپتوزیز در سلولهای k562 آلوده به وکتور کلون شده در مقایسه با سلول های کنترل به میزان قابل توجهی در 24، 48 و 72 ساعت پس از انتقال وکتور افزایش یافت. این افزایش وابسته به زمان بود بطوری که میزان آپوپتوزیز حاصل از غلظت 0.8 میکرومولار در سلولهای حاوی وکتور کلون شده پس از 72 ساعت معادل (3.2±(p<0.0)%(36 بود در حالیکه این میزان در سلولهای حاوی وکتور کنترل، سلول های حاوی کنترل منفی و سلول های نرمال به ترتیب معادل (0.6±4.8)%, (0.86±5.2)%, (0.23±5.05)% بود. در میزان آپوپتوزیز در سلولهای کنترل با گذشت زمان تغییری مشاهده نشد. در حالیکه در سلول های آلوده با وکتور کلون شده متناسب با زمان میزان آپوپتوزیز نیز بطور معنی داری افزایش نشان می دهد. افزایش آپوپتوز با کاهش میزان mrna ژن bcr/ab1 همراه بود که بیانگر تخریب mrna توسط sirna داخل سلولی و ارتباط آن با آپوپتوزیز است.

نتیجه گیری: وکتور بیان کننده sirna بر علیه bcr/abl بطور موفقیت آمیز کلون شده و نتایج حاصل از مطالعه نشان دهنده بیان داخل سلولی sirna توسط این وکتور بود که از طریق کاهش میزان mrna ژن bcr/ab1 به طور موثری آپوپتوزیز را در سلولهای k562 القاء نمود. لذا استفاده از وکتور بیان کننده sirna می تواند بعنوان یک روش مولکولی جدید به منظور خاموش کردن ژن در درمان سرطان های مختلف بویژه cml مورد توجه قرار گیرد.