تخلیص و بررسی خصوصیات مولکولی پارااکسوناز سرم انسان

هدف: هدف تخلیص پاراکسوناز -1 سرم انسان که به نظر می رسد یکی از آنزیم های موثر در خنثی سازی مواد ارگانوفسفات است، می باشد.

روش بررسی: در این تحقیق دو نوع ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی (deae sephadex a-50) غربال مولکولی (sephadex g-200) برای تخلیص این آنزیم مناسب شناخته شد. با استفاده از دترجنت غیریونی، آنزیم از ساختار لیپوپروتئین hdl جدا گردید. پس از اتصال آنزیم به ستون تعویض یون با شستشوی متناوب پروئین های ناخواسته و غیرمتصل از ستون خارج گردید. آنزیم مورد نظر با استفاده از شیب غلظتی از کلریدسدیم خارج و فراکسیون های فعال جمع و بر روی ستون غربال مولکولی برده شد. فراکسیون های فعال خارج شده از این ستون مجددا بر روی ستون تازه تهیه شده از میدیای ستون اول (deae sephadex a-50) برده شد. با این تفاوت که هم بافر تغییر یافته بود و هم ph بافر شستشو نسبت به مرحله اول کاهش یافته بود.

یافته ها: نتایج نشان داد که حاصل تخلیص این روش کروماتوگرافی، آنزیم با درصد خلوص بیش از 95% و فعالیت ویژه 320 واحد بین المللی در میلی گرم پروتئین است. با استفاده از ژل پلی آکریل آمید (sds-page) تنها یک باند پروتئینی در محدوده 43 کیلودالتون مشاهده شد. بررسی مطالعات سینیتیکی نشان داد میل ترکیبی آنزیم با سوبستراهای مختلف وابسته به بافر و یون کلسیم و سدیم است. چنان که با استفاده از سوبسترای پارااکسون هیدرولیز پارااکسون توسط آنزیم تخلیص شده وابسته به کلسیم و کلرید سدیم بود (k_m = 1.39 ± 0.52). در صورتیکه هیدرولیز فنیل استات نیاز به کلرید سدیم و کلسیم نداشت (k_m = 0.728 ± 0.105). حداکثر فعالیت آنزیم برای هیدرولیز پارااکسون در محدوده ph برابر 11-9.5 و برای فنیل استات در محدوده 8.5-8 بود. گلیسرول 20% (حجمی-حجمی) بهترین پایدار کننده در دمای 25 درجه سانتی گراد شناخته شد. بطوری که پس از مدت 20 روز در این دما بیش از 75% فعالیت اولیه آنزیم باقی بود. بر عکس در دمای 56 درجه سانتی گراد سولفات آمونیوم عملکرد بهتری را نشان داد. آنزیم تخلیص شده توسط غلظت های میکرومولار edta و یون روی (zn²⁺) مهار گردید. غلظت های مهاری 50 درصدی (ic₅₀) در حضور کلسیم برای هر دو مهار کننده افزایش یافت.

نتیجه گیری: روش بکار رفته ارزان و سریع است بطوری که می توان با استفاده از این روش مقدار زیادی از این آنزیم را تخلیص و آلودگی و مسمویت با ارگانو فسفات ها را از بین برد.